Nel 1922 si laureò in fisica alla Scuola Normale di Pisa. Tra il 1923 e il 1924 lavorò con Max Born a Gottinga e poi con Ehrenfest a Leida. Dal 1924 al 1926 fu professore incaricato di fisica matematica all'Università di Firenze. Nel 1926 scoprì la legge statistica, oggi nota come statistica di Fermi, e nello stesso anno vinse la cattedra di fisica teorica all'Università di Roma (posto che mantiene fino al 1938, quando - subito dopo aver vinto il premio Nobel - fuggì con la famiglia negli Stati Uniti, alla Columbia University di New York). Nel 1933 propose la sua teoria del decadimento b e, nel 1934, ottenne i primi isotopi radioattivi dal bombardamento con neutroni. Nel 1942 si trasferisce al Metallurgical Laboratory di Chicago dove iniziò la costruzione di un reattore nucleare. Tra 1944 e il 1946 lavorò a Los Alamos alla realizzazione della bomba atomica. Dopo la guerra accettò l'incarico di professore di fisica all'Università di Chicago, dove rimase fino alla morte, che sopraggiunse a causa di un cancro.